RNAscope助力in vivo CAR-T非临床研究：精准破解脱靶与追踪难题

　　自2017年首款产品获批上市，ex vivo CAR-T 虽在血液肿瘤领域展现出划时代的疗效，但其复杂的体外制备工艺带来的高成本与长周期仍是行业痛点。当前，细胞治疗的研发重心正加速向 in vivo CAR-T（体内 CAR-T）转移，该疗法通过工程化载体在体内直接重编程免疫细胞，从根源上攻克体外制备的生产瓶颈，有望重新定义下一代细胞治疗的发展模式。

　　In vivo CAR-T通过工程化病毒载体或脂质纳米颗粒（LNPs）递送遗传物质，在体内直接改造免疫细胞。因此，in vivo CAR-T兼具基因治疗与细胞治疗的双重属性，其“体内生成”的独特机制，给非临床研究带来了前所未有的挑战[1]：

　　体内追踪：载体和CAR转基因在体内的生物分布如何？如何精准追踪CAR+ 细胞类型？

　　“脱靶毒性”：递送系统是否会感染非靶细胞？

　　面对这些挑战，基于原位杂交的RNAscope技术，凭借其极高的特异性和灵敏度，正逐渐成为in vivo CAR-T非临床评价的十分重要的工具或者尤其是病毒载体非临床评价必不可少的工具。

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　　RNAscope原理

　　RNAscope 是一种基于专利 “ZZ” 双探针设计的高灵敏度原位杂交（ISH）技术，通过多级信号放大，可在保留组织空间结构的同时，实现单分子水平的 RNA 目标可视化检测 。其原理与流程如图1所示：

　　第一步：对细胞或组织进行固定与透化处理，使探针能够接触到靶标RNA。

　　第二步：靶标RNA 特异性寡核苷酸探针（Z 探针） 以成对形式（ZZ）与多个靶标 RNA 进行杂交。

　　第三步：多个信号放大分子与特异性靶标探针杂交，每种独特的标记探针均偶联有不同的荧光团或酶。

　　第四步：使用落射荧光显微镜（荧光标记）或普通明场显微镜（酶标记）检测信号。

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　　RNAscope的优势

　　高特异性：双Z探针设计确保只有完全匹配的探针对才能启动放大，有效防止非特异性结合信号被放大，源头保障准确性。

　　高灵敏度：即使目标RNA发生部分降解，约20对探针的协同作用仍能实现稳定、可靠的单分子级检测。可适用于常规 FFPE 等组织切片。

　　空间信息（原位单细胞级）：直接在组织原位检测，提供RNA表达的空间分布与细胞形态学背景。

　　多重检测：支持在同一张切片上同时检测多个RNA靶标，并可实现RNA与蛋白的共定位分析。

　　时效快（无需开发抗体）：直接针对mRNA 序列设计探针，避开了新型 scFv 抗体开发耗时且易交叉反应的难题，极大缩短非临床评价周期 。

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　　RNAscope在in vivo CAR-T

　　非临床研究中的应用价值

　　价值一：破解in vivo CAR-T"追踪"迷局

　　在非临床生物分布研究中，传统的检测手段（如qPCR或免疫组化IHC）往往存在局限性，无法满足in vivo CAR-T的空间定位、微量检测的双重需求。qPCR虽然灵敏，但需要匀浆组织，丢失了关键的空间微环境信息；而IHC则受限于抗体特异性与灵敏度。如前所述，RNAscope针对mRNA序列设计探针避开了蛋白层面的检测难题。此外，RNAscope 技术能够实现CAR基因表达的“细胞级别”精准定位和微量RNA分子的可视化，从而实现in vivo CAR-T的体内精准追踪。

　　价值二：评估 “在靶/脱瘤”（On-target / Off-tumor）与“脱靶”风险

　　在in vivo CAR-T的非临床安全性评价中，RNAscope 在针对“在靶/脱瘤”与“脱靶”风险的检测中，同样展现出独特优势。

　　“在靶/脱瘤”毒性是CAR-T研发的重大风险。早在2010年，靶向ERBB2 (HER2) 的CAR-T细胞在临床试验中因识别肺上皮细胞上的低表达HER2，引发了致命的肺毒性 [3]。

　　RNAscope能够敏锐捕捉正常组织（如心、肺、脑等关键脏器）中常规IHC无法检出的微量靶抗原mRNA表达，从而在非临床阶段为临床给药剂量的制定提供早期的风险预警。

　　In vivo CAR-T最核心的安全性考量是非靶细胞的异常转导。通过RNAscope的多重荧光或显色杂交（Multiplex Assay），可以在同一组织切片上同时标记：

　　目标递送分子（如CAR mRNA）

　　宿主靶细胞标记物（如CD3/CD8/CD56 mRNA）

　　潜在脱靶器官细胞标记物（如Albumin标记肝细胞）

　　通过共定位分析（Co-localization），能够直观地在单细胞分辨率下判定载体是精准重编程了靶细胞，还是误伤了肝脏等实质脏器细胞。

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　　应用案例

　　在Umoja Biopharma的UB-VV100临床前研究中，研究人员利用RNAscope多色荧光技术，在CD34人源化NSG小鼠和犬中，通过半定量共定位分析鉴定表达 UB VV100 RNA 转录本的细胞类型[4]。

　　在NSG小鼠腹腔给药研究中证实，在脾脏和肝脏中转导的细胞主要为两类（图2），人 T 细胞（转基因阳性细胞中，人 CD3 占 0–10%）和小鼠巨噬细胞（转基因阳性细胞中，鼠 CD68 占 91–100%）。

　　在犬体内经淋巴结内或腹腔注射后的组织分布研究中，两种给药途径下，绝大多数转导事件（淋巴结样本中＞70%～＞99%）均发生在免疫细胞中（转基因阳性且犬 CD45 阳性），包括巨噬细胞（转基因阳性且犬 CD68 阳性）和 T 细胞（转基因阳性且犬 CD3 阳性）。

　　白色为 DAPI 细胞核染色；绿色表示人源 CD3；黄色表示转导细胞的 RACR 序列；红色表示鼠源 CD68；蓝色表示鼠源 CD45

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　　科技赋能

　　加速in vivo CAR-T临床转化

　　invivo CAR-T的研发不仅是靶点与载体的创新，对非临床药代动力学与毒理学的评价技术提出了极高要求。在这个过程中，精准的数据就是最好的通行证。

　　益诺思依托先进的分子病理平台，已成功将RNAscope非临床评价项目中。益诺思深度理解国内外in vivo CAR-T 的监管逻辑与药企研发项目痛点，依托成熟的分子病理平台，以严谨的实验数据链为核心，助力药企攻克体内 CAR-T 研发中的脱靶检测与体内追踪难题，加速产品的临床转化进程。